Biofizyka oddziaływań białek i mRNA podczas inicjacji translacji w organizmach eukariotycznych

Białko eIF4E związane z m7GDP

Osoby zaangażowane
Ryszard Stolarski 
Anna Modrak-Wójcik

Współpraca w Zakładzie Biofizyki
Edward Darżynkiewicz
Joanna Żuberek

Pozostali współpracownicy

Richard E. Davis, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Colorado, Aurora CO U.S.A.;

Joanna Trylska, Jacek Jemielity Centre of New Technology, University of Warsaw (CeNT)

Anna Niedzwiecka, Michał Wojciechowski, Marek Cieplak, Labolatory of Biological Physics (SL4), Institute of Physics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland

Wiktor Koźmiński University of Warsaw Biological and Chemical Research Centre (CNBCh)

Słowa kluczowe
czynniki białkowe: eIF4E, eIF4G, 4E-BP, CBC
RNA 5' cap
oddziaływania międzycząsteczkowe
spektroskopia molekularna
ultrawirowanie analityczne
termodynamika asocjacji i mikrokalorymetria
dynamika molekularna i obliczenia kwantowe

Opis projektu

Ogólnym celem badań jest poznanie molekularnego mechanizmu specyficznego rozpoznawania makrocząsteczek w języku fizyki oddziaływań i określenie termodynamicznych podstaw stabilności kompleksów białko - RNA w procesach ekspresji genów w komórkach eukariotycznych: inicjacja biosyntezy białek (translacja mRNA) , składanie RNA (splicing) i transport wewnątrzkomórkowy. W badaniach są wykorzystywane syntetyczne, chemicznie modyfikowane analogi 5' mRNA kapu (współpraca z grupą badawczą prof. E. Darżynkiewicza) i rekombinowane czynniki białkowe. Znaczące osiągnięcia uzyskano w zakresie analizy dwuskładnikowych kompleksów kapu z białkami eIF4E (eukariotic initiation factor 4E: mysi, ludzki, z C. elegans, z nicieni). Opracowana przez dr A. Niedźwiecką metoda miareczkowania fluorescencyjnego umożliwiła precyzyjne wyznaczenie stałych asocjacji kompleksów i określania stopnia aktywności białka (nieenzymatycznego). Wyznaczenie wkładów do energii swobodnej Gibbsa od poszczególnych oddziaływań stabilizujących w kompleksie białko-kap oraz termodynamicznych parametrów asocjacji (entalpia, entropia, ciepło właściwe przy stałym ciśnieniu) pozwoliło zaproponować dwuetapowy model wiązania: wstępna stabilizacja kapu w centrum aktywnym eIF4E poprzez reszty fosforanowe, a następnie utworzenie specyficznych, kooperatywnych oddziaływań warstwowych kation - pi i wiązań wodorowych. Analogiczne badania oddziaływania kompleksu CBC (cap-binding complex, podjednostki CBP20 i CBP80) z analogami kapu pokazały m. in. kluczowe znaczenie drugiego nukleotydu kapu (pierwszy transkrybowany) oraz rolę poszczególnych tyrozyn podjednostki CBP20 w procesie rozpoznawania i stabilizacji końca 5' mRNA. Zagadnienie istotnych różnic w specyficznym wiązaniu dwóch typów kapu, monometyloguanozynowego (MMG-kap) i trimetyloguanozynowego rozwiązano wstępnie na gruncie dynamicznego modelu ruchów pętli ograniczających dostęp do centrów aktywnym białek (komputerowe symulacje dynamiki molekularnej). Połączenie pomiarów NMR i teoretycznych obliczeń przesunięć chemicznych, stałych sprzężenia i rozkładów gęstości ładunku elektronowego pozwoliły jednoznacznie zlokalizować nadmiarowy ładunek dodatni na N(7) pierścienia 7-metyloguaninowego, w przeciwieństwie do zakładanego przedtem modelu z rozmyciem tego ładunku pomiędzy N(7) i N(9). Aktualnie badania przesunęły się w stronę kompleksów trójskładnikowych z udziałem mRNA 5' kap, eIF4E oraz 4E-BP (4E binding protein) lub dużych, kilkudomenowych fragmentów eIF4G. W szczególności, poprzez zastosowanie techniki analitycznego ultrawirowania wykazano przeciwstawną kooperatywność miejsc wiążących eIF4E w stosunku do kapu i do 4E-BP1 w zależności od kolejności ich przyłączania do eIF4E.

Wybrane publikacje

  1. Jasiński M., Kulik M., Wojciechowska M., Stolarski R., Trylska J.: Interactions of 2'-O-methyl oligoribonucleotides with the RNA models of the 30S subunit A-site, PLOS ONE, 2018 (https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191138).
  2. Kasprzyk R., Kowalska J., Wieczorek Z., Szabelski M., Stolarski R., Jemielity J.: Acetylpyrene-labelled 7-methylguanine nucleotides: unusual fluoresence properties and application to decapping scavanger activity monitoring, Organic & Biomolecular Chemistry 14, 3863-3868, 2016 (DOI: 10.1039/c6ob00419a).
  3. Modrak-Wójcik A., Wisniewska M., Stolarski R.: Bis-ANS as a tool to monitor conformational changes upon assembly of binary and ternary complexes of eIF4E, 4E-BP1 inhibitory protein, and the mRNA 5' cap, Protein Science 24 (S1), 171-172, 2015.
  4. Modrak-Wojcik, A., Gorka, M., Niedzwiecka, K., Zdanowski, K., Zuberek, J., Niedzwiecka, A., Stolarski, R.: Eukaryotic translation initiation is controlled by cooperativity effects within ternary complexes of 4E-BP1, eIF4E, and the mRNA 5’ cap, FEBS Letters 587, 3928-3934, 2013.
  5. Liu, W., Jankowska-Anyszka, M., Piecyk, K., Dickson, L., Wallace, A., Niedźwiecka, A., Stępiński, J., Stolarski, R., Darżynkiewicz, E., Kieft, J., R. Zhao, R., Jones, D.N.M., Davis, R.E.: Structural Basis for Nematode eIF4E binding an m2,2,7G-Cap and its implications for translation initiation, Nucleic Acids Research 39, 8820-8832, 2011.
  6. Kiraga-Motoszko, K., Niedzwiecka, A. Modrak-Wojcik, A., Stepinski, J., Darzynkiewicz, E., Stolarski, R.: Thermodynamics of molecular recognition of mRNA 5' cap by yeast eukaryotic initiation factor 4E, Journal of Physical Chemistry B 115, 8746-8754, 2011.
  7. Ruszczynska-Bartnik K, Maciejczyk M, R. Stolarski: Dynamical insight into Caenorhabditis elegans eIF4E recognition specificity for mono- and trimethylated structures of mRNA 5' cap, Journal of Molecular Modeling 17, 727-737, 2011.
  8. Worch R., Jankowska-Anyszka M., Niedzwiecka A., Stepinski J., Mazza C., Darzynkiewicz E., Cusack S., Stolarski R.: Diverse role of three tyrosines in binding of the RNA 5' cap to the human nuclear cap binding complex, Journal of Molecular Biology 385, 618-627, 2009.
  9. Worch, R. Stolarski, R.: Stacking efficiency and flexibility analysis of aromatic amino acids in cap-binding proteins, Proteins: Structure, Function, Bioinformatics 71, 2026-2037, 2008.
  10. Rutkowska-Włodarczyk, I., Stępiński, J., Dadlez, M., Darżynkiewicz, E., Stolarski, R., Niedźwiecka A.: Structural changes of eIF4E upon binding to the mRNA 5'monomethylguanosine and trimethylguanosine cap, Biochemistry 47, 2710-2720, 2008.
  11. Niedzwiecka, A.,Stępiński, J., Antosiewicz, J.M., Darżynkiewicz, E., Stolarski R.: Biophysical approach to studies of cap-eIF4E interaction by synthetic cap analogs, Methods in Enzymology 430, 209-245, 2007.
  12. Worch, R., Niedzwiecka, A., Stepinski, J., Mazza, C., Jankowska-Anyszka, M., Darzynkiewicz, E., Cusack, S. and Stolarski, R.: Specificity of recognition of mRNA 5' cap by human nuclear cap-binding complex. RNA 11, 1355-1363, 2005
  13. Westman, B., Beeren, L., Grudzien, E., Stepinski, J., Worch, R., Zuberek, J., Jemielity, J., Stolarski, R., Darzynkiewicz, E., Rhoads, R.E. and Preiss, T.: The antiviral drug ribavirin does not mimic the 7-methylguanosine moiety of the mRNA cap structure in vitro. RNA 11, 1505-1513, 2005.
  14. Niedzwiecka, A., Darzynkiewicz, E., and Stolarski, R.: Thermodynamics of mRNA 5' Cap Binding by Eukaryotic Translation Initiation Factor eIF4E. Biochemistry 43, 13305-13317, 2004.
  15. Zuberek, J. Jemielity, J., Jablonowska, A., Stepinski, J., Dadlez, M., Stolarski, R., and Darzynkiewicz, E.: Influence of Electric Charge Variation at Residues 209 and 159 on the Interaction of eIF4E with the mRNA 5' Terminus. Biochemistry 43, 5370-5379, 2004
  16. Stolarski R.: Thermodynamics of Specific protein-RNA interactions. Acta Biochimica Polonica 50, 297-318, 2003
  17. Zuberek, J., Wyslouch-Cieszynska, A., Niedzwiecka, A., Dadlez, M., Stepinski, J., Augustyniak, W., Gingras, A.-C., Zhang, Z., Burley, S.K., Sonenberg, N., Stolarski, R., and Darzynkiewicz E. : Phosphorylation of eIF4E Attenuates Its Interaction with mRNA 5' Cap Analogs by Electrostatic Repulsion: Intein-mediated Protein Ligation Strategy to Obtain Phosphorylated Protein. RNA 9, 52-61, 2003
  18. Jemielity, J.,Fowler, T., Zuberek, Stepinski, J., Lewdorowicz, M., Niedzwiecka, A., Stolarski, R., Darzynkiewicz, E., and Rhoads, R.E. : Novel "Anti-Reverse" Cap Analogs with Superior Translational Properties. RNA 9, 1108-1122, 2003
  19. Ruszczynska, K., Kamienska-Trela, K., Wojcik, J. Stepinski, J., Darzynkiewicz, E., and Stolarski, R.: Charge Distribution in 7-Methylguanine Regarding Cation-pi Interaction with Protein Factor eIF4E. Biophysical Journal 85, 1450-1456, 2003
  20. Niedzwiecka, A., Stepinski, J., Darzynkiewicz, E., Sonenberg, N., and Stolarski, R.: Positive heat capacity change upon specific binding of translation initiation factor eIF4E to mRNA 5' cap. Biochemistry 41 (40):12140-12148, 2002.
  21. Niedzwiecka, A., Marcotrigiano, J., Stepinski, J., Jankowska-Anyszka, M., Wyslouch- Cieszynska, A., Dadlez, M., Gingras, A.-C., Mak, P., Darzynkiewicz, E., Sonenberg, N., Burley, S.K. & Stolarski, R.: Biophysical Studies of eIF4E cap-Binding Protein: Recognition of mRNA 5' cap Structure and Synthetic Fragments of eIF4G and 4E-BP1 Proteins, Journal of Molecular Biology 319, 615-635, 2002
  22. Stępiński, J., Waddell, C., Stolarski, R., Darżynkiewicz, E. & Rhoads, R.E.: Synthesis and Properties of mRNAs Containing the Novel "Anti-Reverse" cap Analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG, RNA 7, 1486-1495, 2001