Strona Domowa
Uniwersytet Warszawski Wydzial Fizyki
ENGLISH VERSION  Badania    Osoby    Edukacja

Biofizyka oddziaływań białek i mRNA podczas inicjacji translacji w organizmach eukariotycznych
 
Białko eIF4E związane z m7GDP

Osoby zaangażowane:
Ryszard Stolarski
Anna Niedzwiecka
Anna Modrak-Wójcik
Katarzyna Ruszczyńska
Remigiusz Worch

Współpraca w Zakładzie Biofizyki:
Edward Darżynkiewicz
Jan Antosiewicz

Pozostali współpracownicy:
Robert E. Rhoads, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Louisiana State University Health Center (LSUHSC), Shreveport, Louisiana, U.S.A.;
Stephen Cusack, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Grenoble, France;
Richard E. Davis, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Colorado, Aurora CO U.S.A.;
Jacek Wójcik, Nuclear Magnetic Resonance Laboratory, Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland (Head: Dr. hab. Andrzej Ejchart);
Michał Dadlez, Department of Biophysics and Mass Spectrometry Laboratory, Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland (Head: Prof. Andrzej Bierzyński);
Andrzej Jaworski, Faculty of Physics, Warsaw University of Technology;
 

 Słowa kluczowe:
czynniki białkowe: eIF4E, eIF4G, 4E-BP, CBC
RNA 5' cap
oddziaływania międzycząsteczkowe
spektroskopia molekularna
termodynamika i mikrokalorymetria
dynamika molekularna
obliczenia kwantowe
 

Opis projektu:
Ogólnym celem badań jest poznanie molekularnego mechanizmu specyficznego rozpoznawania makrocząsteczek i znalezienia termodynamicznych podstaw stabilności kompleksów białko - RNA w procesach ekspresji genu w komórkach eukariotycznych: inicjacja biosyntezy białek (translacja), składanie RNA (ang. splicing) i transport wewnątrzkomórkowy. Głównym przedmiotem zainteresowania są oddziaływania różnych czynników białkowych z końcem 5' kwasów rybonukleinych RNA, tzw. "kapem, w którym 7-metyloguanozyna jest połączona mostkiem trifosforanowym z następnym nukleozydem, pierwszym transkrybowanym. W badaniach wykorzystujemy syntetyczne analogi kapu (współpraca z grupą badawczą prof. E. Darżynkiewicza, Zakład Biofizyki IFD) i rekombinowane białka, które wiążą kap. Aktualnie badane białka to różne izoformy eukariotycznego czynnika translacyjnego eIF4E (ang. eukaryotic initiation factor 4E), regulatorowe białko 4E-BP1 (ang. 4E-binding proteins lub PHAS-I, phosphorylated heat- and acid-stable protein regulated by insulin) i fragmenty białka adaptorowego eIF4G stanowiącego trzon kompleksu inicjacyjnego eIF4F, wszystkie zaangażowane w proces inicjacji translacji, wielofunkcyjny, jądrowy kompleks białkowy CBC (podjednostki CBP80 i CBP20) uczestniczący m. in. w procesie transportu RNA jądro - cytoplazma i splicingu, oraz enzymy biorące udział w degradacji RNA, np. DcpS (ang. decapping scavanger). Badane białka są uzyskiwane na drodze nadekspresji w Laboratorium Ekspresji Genu w Zakładzie Biofizyki IFD lub uzyskiwane w ramach współpracy zarówno innych ośrodków. Stosujemy zarówno metody doświadczalnymi, takie jak spektroskopia emisyjna (fluorescencja stanu stacjonarnego i zatrzymanego przepływu), magnetyczny rezonans jądrowy NMR, mikrokalorymetria izotermiczna, spektrometria masowa, rentgenografia, jak i symulacje komputerowe klasycznej dynamiki molekularnej i kwantowe obliczenia energii stabilizacji modelowych układów zasada RNA-aminokwas (metoda perturbacyjna MP2 na poziomie SCF-HF). Opracowane przez nas nowe podejście metodologiczne przy pomiarach wygaszania fluorescencji tryptofanów białka pod wpływem przyłączania ligandów stworzyło możliwość nie tylko precyzyjnego wyznaczania równowagowych stałych asocjacji (Kas) białek z ligandami w różnych temperaturach i warunkach roztworu, lecz również pozwoliło na określenie stopnia aktywności białka nieenzymatycznego, co było dotąd niemożliwe Metodologia ta znalazła również zastosowanie do wyznaczania stechiometrii kompleksów enzymów oligomerycznych z ligandami. Wszechstronne badania fluorescencyjne i kalorymetryczne w połączeniu rentgenografią dwuskładnikowych kompleksów z udziałem analogów kapu i białek eIF4E, w tym jego formą ufosforylowaną i nowoodkrytymi homologami IFE z nicieni C. elegans, oraz kompleksów trójskladnikowe, z dodaniem fragmentów białek eIF4GI, eIF4GII (eukaryotic initiation factor 4GI i 4GII) lub 4E-BP1 o różnym stopniu ufosforylowania pozwoliły wyznaczyć wkłady do energii swobodnej Gibbsa ( DG°) pochodzące od poszczególnych oddziaływań pomiędzy kapem i eIF4E w centrum wiążącym białka. Zależności Kas od siły jonowej i pH dostarczyły szczegółowych informacji o wymianie jonów (K+, H+) i cząsteczek wody między powłoką hydratacyjną makrocząsteczek tworzących kompleks i otaczającym roztworem, oraz o przekształceniach konformacyjnych eIF4E. Uzyskano potwierdzenie elektrostatycznego charakteru sterowania analogów kapu do centrum aktywnego eIF4E. Zaproponowaliśmy dwuetapowy model oddziaływania eIF4E koniec 5': (1) kap jest wiązany poprzez grupy fosforanowe, (2) wstępna stabilizacja kapu umożliwia utworzenie dalszych, całkowicie kooperatywnych kontaktów międzycząsteczkowych: oddziaływania warstwowego (ang. stacking) typu kation-p i wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka. Z równania van't Hoffa wyznaczono parametry termodynamiczne, opisujące asocjację eIF4E z analogami kapu: zależne od temperatury entalpie (DH°) i entropie (DS°) standardowe oraz zmiany pojemności cieplnej przy stałym ciśnieniu (DC°P). Nietypowe, dodatnie wartości DC°P dla wiązania niektórych analogów kapu zostały potwierdzone w niezależnym eksperymencie miareczkowania kalorymetrycznego (ITC). Uzyskano również interesujące wyniki na drodze do określenia biologicznej roli fosforyzacji eIF4E w regulowaniu procesu inicjacji translacji. Analogiczne badania oddziaływania kompleksu białkowego CBC z analogami kapu pokazały m. in. kluczowe znaczenie drugiego nukleotydu kapu (pierwszy nukleotyd transkrybowany) i zmian konformacyjnych podjednostki CBP20 w procesie rozpoznania i stabilizacji końca 5' RNA w centrum wiążącym CBC. Energie stackingu wyliczone kwantowo dla oddziaływań aminokwasów aromatycznych z zasadami RNA w szerokiej klasie kompleksów białko - RNA o znanych strukturach krystalograficznych (geometrii wzajemnego ustawienia pierścieni aromatycznych) pokazały szczególną rolę efektów entropowych w specyficznym rozpoznaniu obu typów polimerów biologicznych. Połączenie pomiarów NMR dla N-15, C-13 podwójnie znakowanych pochodnych 7-metyloguaniny, oraz teoretycznych obliczeń przesunięć chemicznych, stałych sprzężenia i rozkładów gęstości ładunku pozwoliły jednoznacznie zlokalizować nadmiarowy ładunek dodatni na N(7) pierścienia pięcioczłonowego, w przeciwieństwie do dotychczas przyjmowanego rozmycia pomiędzy N(7) i N(9).

Wybrane publikacje:
  1. Worch, R., Niedzwiecka, A., Stepinski, J., Mazza, C., Jankowska-Anyszka, M., Darzynkiewicz, E., Cusack, S. and Stolarski, R.: Specificity of recognition of mRNA 5' cap by human nuclear cap-binding complex. RNA 11, 1355-1363, 2005
  2. Westman, B., Beeren, L., Grudzien, E., Stepinski, J., Worch, R., Zuberek, J., Jemielity, J., Stolarski, R., Darzynkiewicz, E., Rhoads, R.E. and Preiss, T.: The antiviral drug ribavirin does not mimic the 7-methylguanosine moiety of the mRNA cap structure in vitro. RNA 11, 1505-1513, 2005.
  3. Kalek, M., J., Jemielity, Darzynkiewicz, Z., Bojarska, E., Stepinski, J., Stolarski, R., Davis, E.R. and Darzynkiewicz, E. Enzymatically stable 5' mRNA cap analogs: Synthesis and binding studiem with human DcpS decapping enzyme. Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 3223-3230, 2006.
  4. Niedzwiecka, A., Darzynkiewicz, E., and Stolarski, R.: Thermodynamics of mRNA 5' Cap Binding by Eukaryotic Translation Initiation Factor eIF4E. Biochemistry 43, 13305-13317, 2004.
  5. Grudzien, E., Stepinski, J., Jankowska-Anyszka, M., Stolarski, R., Darzynkiewicz, E., and Rhoads, R.E.: Novel Cap Analogs for in vitro Synthesis of mRNAs with High Translational Efficiency. RNA 10, 1479-1487, 2004
  6. Zuberek, J. Jemielity, J., Jablonowska, A., Stepinski, J., Dadlez, M., Stolarski, R., and Darzynkiewicz, E.: Influence of Electric Charge Variation at Residues 209 and 159 on the Interaction of eIF4E with the mRNA 5' Terminus. Biochemistry 43, 5370-5379, 2004
  7. Lewdorowicz, M., Yoffe, Y., Zuberek, J., Jemielity, J., Stepinski, J., Kierzek, R., Stolarski, R., Shapira, M., and Darzynkiewicz, E.: Chemical Synthesis and binding activity of the trypanosomatid cap-4 structure. RNA 10, 1469-1478, 2004
  8. Stolarski R.: Thermodynamics of Specific protein-RNA interactions. Acta Biochimica Polonica 50, 297-318, 2003
  9. Zuberek, J., Wyslouch-Cieszynska, A., Niedzwiecka, A., Dadlez, M., Stepinski, J., Augustyniak, W., Gingras, A.-C., Zhang, Z., Burley, S.K., Sonenberg, N., Stolarski, R., and Darzynkiewicz E. : Phosphorylation of eIF4E Attenuates Its Interaction with mRNA 5' Cap Analogs by Electrostatic Repulsion: Intein-mediated Protein Ligation Strategy to Obtain Phosphorylated Protein. RNA 9, 52-61, 2003
  10. Jemielity, J.,Fowler, T., Zuberek, Stepinski, J., Lewdorowicz, M., Niedzwiecka, A., Stolarski, R., Darzynkiewicz, E., and Rhoads, R.E. : Novel "Anti-Reverse" Cap Analogs with Superior Translational Properties. RNA 9, 1108-1122, 2003
  11. Ruszczynska, K., Kamienska-Trela, K., Wojcik, J. Stepinski, J., Darzynkiewicz, E., and Stolarski, R.: Charge Distribution in 7-Methylguanine Regarding Cation-pi Interaction with Protein Factor eIF4E. Biophysical Journal 85, 1450-1456, 2003
  12. Niedzwiecka, A., Stepinski, J., Darzynkiewicz, E., Sonenberg, N., and Stolarski, R.: Positive heat capacity change upon specific binding of translation initiation factor eIF4E to mRNA 5' cap. Biochemistry 41 (40):12140-12148, 2002.
  13. Niedzwiecka, A., Marcotrigiano, J., Stepinski, J., Jankowska-Anyszka, M., Wyslouch- Cieszynska, A., Dadlez, M., Gingras, A.-C., Mak, P., Darzynkiewicz, E., Sonenberg, N., Burley, S.K. & Stolarski, R.: Biophysical Studies of eIF4E cap-Binding Protein: Recognition of mRNA 5' cap Structure and Synthetic Fragments of eIF4G and 4E-BP1 Proteins, Journal of Molecular Biology 319, 615-635, 2002
  14. Stępiński, J., Waddell, C., Stolarski, R., Darżynkiewicz, E. & Rhoads, R.E.: Synthesis and Properties of mRNAs Containing the Novel "Anti-Reverse" cap Analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'-deoxy)GpppG, RNA 7, 1486-1495, 2001
  15. Cai, A., Jankowska-Anyszka, M., Centers, A., Chlebicka, L., Stępiński, J., Stolarski, R., Darżynkiewicz, E. & Rhoads, R.E.: Quantitative Assessment of mRNA cap Analogs as Inhibitors of in vitro Translation, Biochemistry 38, 8538-8547, 1999
  16. Jankowska-Anyszka, M., Lamphear, B.J., Aamodt, E.J., Harrington, T., Darżynkiewicz, E., Stolarski, R. & Rhoads, R.E.: Multiple Isoforms of Eukaryotic Protein Synthesis Initiation Factor 4E in Caenorhabditis elegans Can Distinguish between Mono- and Trimethylated mRNA cap Structures, Journal of Biological Chemistry 273, 10538-10542, 1998

Finansowanie:

Projekt badawczy finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego 3P04A 021 25 (2003 - 2006):
"Specyficzne oddziaływania fragmentów RNA zawierających 5' cap z białkami; biofizyka mechanizmów molekularnych i zastosowania w projektowaniu leków"
(kier. Ryszard Stolarski)

Projekt badawczy finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (grant promotorski, mgr Remigiusz Worch) N301 007 31/0154 (2006-2007):
"Analiza oddziaływania jądrowego kompleksu białkowego ze strukturą 5' końca RNA metodami biofizyki molekularnej" (kier. Ryszard Stolarski)

Projekt badawczy finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego 2 P04A 006 28 (2005-2008):
"Struktura i funkcja kapu-4 u wczesnych eukariotow - trypanosomatydow; jego chemiczne analogi jako potencjalne leki przeciwko Leishmanii"
(kier. Edward Darżynkiewicz)
 

Propozycje prac magisterskich