Mechanizm działania wybranych makrocząsteczek biologicznych i ich składników za pomocą spektroskopii absorpcyjnej, emisyjnej i kinetyki enzymatycznej, w tym technik czasowo-rozdzielczych

Oddziaływania enzymu (E) z ligandem (L) wywołują znamienny wzrost średniego czasu zaniku emisji ligandu (Stoychev i wsp., 2003) i rezonansowy transfer energii wzbudzenia fluorescencji (FRET) między resztami tyrozynowymi enzymu i ligandem (Kierdaszuk i wsp., 2000). Dzięki temu możliwa jest identyfikacja tautomeru formycyny B (selektywnego inhibitora)w kompleksie z fosforylazą nukleozydów purynowych (PNP) z E. coli. Zatem spektroskopia emisyjna umożliwiła usunięcie niejednoznaczności w wynikach badań rentgenostrukturalnych (Koellner i wsp., JMB 280, 153-166 (1998).

Osoby zaangażowane
Borys Kierdaszuk
Krzysztof Krawiec

Współpraca w Zakładzie Biofizyki
Anna Modrak-Wójcik

Pozostali współpracownicy
Dr. Matthias Bochtler (Joint MPG-PAN Junior Research Group, International Institute of Molecular and Cell Biology, Warsaw, Poland)

Prof. Gert Dandanell (Institute of Molecular Biology, Department of Biological Chemistry, Copenhagen, Denmark)

Prof. Staffan Eriksson (Department of Veterinary Medicinal Chemistry, Biomedical Center, Uppsala, Sweden)

Dr Maciej Garstka (Department of Metabolism Physiology, Institute of Biochemistry, University of Warsaw, Head: Prof. Bryła)

Prof. Joseph R. Lakowicz (Center for Fluorescence Spectroscopy, University of Maryland at Baltimore, Baltimore, USA)

Prof. Birgitte Munch-Petersen (Department of life Sciences and Chemistry, Roskilde University, Roskilde, Denmark)

Dr hab. Maciej Nowak and Dr hab. Bolesław Kozankiewicz (Institute of Physics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Head: Prof. Jerzy Prochorow).

Dr Jarosław Poznański (Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw)

Prof. Rudolf Rigler (Department of Medical Biophysics, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden)

Laboratorium Spektroskopii Emisyjnej Cząsteczek Biologicznych (LESBM)
Laboratorium umożliwia pomiar fluorescencji i fosforescencji cząsteczek, statycznej i czasowo-rozdzielczej. Wyposażone między innymi w:

  • Laserowe wzbudzenie realizowane za pomocą lasera tytanowo-szafirowego pompowanego przez laser argonowy;
  • Detekcję: zliczanie pojedyńczych fotonów, z rozdzielczością w zakresie pikosekund i nanosekund;
  • Nanosekundowy spektrofluorymetr (IBH System 5000) z lampą impulsową;
  • Samodzielnie skonstruowany fosforymetr, umożliwiający statyczny i czasoworozdzielczy pomiar fosforescencji z rozdzielczością w zakresie milisekund-sekund;
  • Kristat azotowy na zakres 80-300 K, umożliwiący detekcję emisji w szkliwach niskotemperaturowych.

Słowa kluczowe
mechanizm działania enzymów,
oddziaływania enzym-ligand,
spektroskopia absorpcyjna i emisyjna (fluorescencja, fosforescencja),
spektroskopia wysokiej rozdzielczości czasowej, sondy emisyjne,
kinetyka enzymatyczna,
fosforylazy nukleozydów purynowych,
kinazy deoxyrybonukleozydowe,
chloroplasty

Opisy projektów

Projekt A: Mechanizm działania fosforylaz nukleozydów purynowych (PNP) na podstawie badań spektroskopowych, chromatograficznych, kinetycznych i krystalograficznych kompleksów enzym-ligand

Fosforylaza nukleozydów purynowych (PNP) z E. coli katalizuje przerwanie wiązania glikozydowego w rybo- i deoksyrybonukleozydach guaniny i hipoksantyny w organizmach wyższych, jak również adeniny w niektórych prokariota (np. E. coli), w obecności nieorganicznego ortofosforanu (Pi), jako drugiego substratu. Z naturalnymi substratami reakcja jest odwracalna:

β-nukleozyd purynowy + Pi ⇋ zasada purynowa + α-D-1-fosforan pentozy

Równowaga reakcji in vitro jest przesunięta w kierunku syntezy nukleozydu. Jednakże, in vivo fosforoliza znacznie przeważa nad syntezą, z powodu sprzężenia z dwiema dodatkowymi reakcjami enzymatycznymi, tj. z utlenianiem i fosforybozylacją zasady, odpowiednio przez oksydazę ksantynową i fosforybozylotransferazę hipoksantynowo-guaninową.

Enzym PNP jest uważany jako pierwszoplanowy "target" dla selektywnych czynników immunosupresyjnych oraz dla inhibitorów, które zmniejszając aktywność tego enzymu wobec terapeutycznie aktywnych analogów nukleozydów mogłyby zwiększyć ich skuteczność przeciwwirusową i przeciwnowotworową. Natomiast poznanie różnic między ludzkim PNP i mniej specyficznymi enzymami PNP wirusów i bakterii może przyczynić się do zastosowania tych ostatnich w terapii genowej nowotworów.

W E. coli występują dwie fosforylazy nukleozydów purynowych PNP-I i PNP-II, odpowiednio produkty dwóch różnych genów: deoD i xapA.

Znaczny udział w badaniach mechanizmu działania tych enzymów ma także nasz zespół (Włodarczyk & Kierdaszuk, 2003; Kierdaszuk i wsp., 1997, 2000; Kierdaszuk, 2002; Stoychev i wsp., 2001, 2002), szczególnie w zastosowaniach spektroskopii emisyjnej i kinetyki enzymatycznej do wyjaśnienia oddziaływania enzym-ligand. Po raz pierwszy pokazaliśmy wyraźną preferencję PNP-I z E. coli wobec tautomerycznej formy N(2)-H formycyny A i B, która nie zależy od obecności fosforanu. W kompleksie występuje również rezonansowy transfer energii wzbudzenia fluorescencji (FRET) między resztami tyrozynowymi w białku i cząsteczką zasady nukleozydu (zobacz także Rysunek, z lewej strony u góry). Natomiast, strukturalne preferencje enzymu wobec formy amino lub imino N(6)-metyloformycyny A okazały się być wyraźnie zależne od fosforanu, tzn. preferencję wobec formy amino obserwuje się odpowiednio w obecności fosforanu (w kompleksie potrójnym), a wobec formy imino w nieobecności fosforanu, tzn. w kompleksie podwójnym (Kierdaszuk i wsp., 2000; Kierdaszuk, 2002).

Chociaż oddziaływanie fosforanu z enzymem jest bardzo skomplikowane (Kierdaszuk i wsp., 1997), to odzwierciedla ono dwuzakresową kinetykę enzymatyczną, co rozjaśnia dualną (substratowo-regulatorową) rolę fosforanu wobec tego enzymu.

Po raz pierwszy zbadaliśmy także molekularne podstawy różnych własności substratowych ksantozyny i ksantyny wobec PNP-I z E. coli i PNP ze ssaków w tym także PNP-II z E. coli (Stoychev et al., 2002). W naszym modelu wykorzystaliśmy własności tautomeryczne i dysocjację protonu N(3)-H w ksantozynie (pKa = 5.7) i ksantynie (pKa = 7.5), co było dotychczas zignorowane zarówno w przypadku badań aktywności ksantyn wobec PNP jak i innych enzymów, gdzie pochodne te istnieją jako pierwszoplanowe substraty lub jako związki pośrednie w procesach metabolicznych (np. w biosyntezie kofeiny). Zaproponowaliśmy nowy model oddziaływania ksantozyny i ksantyny z PNP, co jest kluczowym elementem reakcji katalitycznej (Stoychev et al., 2002).

Projekt B: Zaskakująca specyficzność substratowa i inhibitorowa czterech ludzkich kinaz deoksynukleozydowych oraz wielofunkcyjnej kinazy z Drosophila

Kinazy deoksyrybonukleozydowe należą do szlaku reutylizacji nukleozydów - salvage pathway, który nazywany jest w literaturze polskojęzycznej szlakiem ratunkowym lub szlakiem rezerwowym. Enzymy te katalizują fosforylację 2'-deoksyrybonukleozydów (dN) do 5'-monofosforanów 2'-deoksyrybonuklezydów (dNMP) w obecności donora fosforanu, będącego najczęściej 5'-trifosforanem nukleozydu (NTP). Znane są dwie kinazy cytoplazmatyczne: kinaza deoksycytydynowa (dCK, fosforylująca 2'-deoksycytydynę oraz 2'-deoksyadenozynę i 2'-deoksyguanozynę), kinaza tymidynowa (TK1, fosforylująca tymidynę); oraz dwie kinazy mitochondriane: kinaza deoksyguanozynowa (dGK, fosforylująca 2'-deoksyguanozynę i 2'-deoksyadenozynę) i thymidynowa (TK2, fosforylująca thymidynę oraz 2'-deoksycytydynę). O ile w cytoplazmie szlak ten uzupełnia syntezę nukleotydów de novo, to ich aktywność w mitochondriach (gdzie nie ma syntezy de novo) jest kluczowa dla replikacji i naprawy mitochondrialnego DNA. Ponadto enzymy te biorą udział w aktywacji metabolicznej (fosforylacji na C(5')) terapeutycznie aktywnych analogów nukleozydów. Zwykle jest to etap limitujący szybkość aktywacji, dlatego bardzo ważne jest dokładne poznanie mechanizmu działania tych enzymów.

Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) zawiera multifunkcjonalną kinazę deoksyrybonukleozydową (dNK) ze znacznie szerszą specyficznością niż kinazy ludzkie. Szczegółowa wiedza o czynnikach odpowiedzialnych za te różnice może umożliwić zastosowanie genu dNK (lub genów innych kinaz, np. wirusowych, zobacz niżej) w terapii genowej nowotworów.

Z drugiej strony, znaczna liczba wirusów zwierzęcych koduje własną kinazę tymidynową, która ze względu na szerszą specyficzność może fosforylować analogi nukleozydów, które nie są akceptowane przez kinazy komórkowe. Na przykład, rodzina wirusów Herpes simplex koduje kinazę tymidynową, która aktywuje (fosforyluje) jeden z najbardziej znanych i powszechnie stosowanych leków - acyklowir - stosowany przeciw opryszczce wirusowej. Różnice między rozpoznawaniem substratów przez kinazy wirusowe i zwierzęce są podstawą skuteczności związków przeciwwirusowych. Poznanie tych różnic zwiększy nasze szanse w batalii przeciwko wielu wirusowym infekcjom.

Kinaza deoksycytydynowa katalizuje reakcję fosforylacji nie tylko w obecności ATP jako donora fosforanu, a także UTP (Krawiec i wsp., 1995) jak również 3'(2')-trifosforanów 2'(3')-deoksyadenozyny (Krawiec i wsp., 1998, 2003) i tripolifosforanu (Krawiec et al., 2003). Pomimo swojej nazwy katalizuje także fosforylację purynowych 2'-deoksyrybonukleozydów.

Pokazaliśmy po raz pierwszy, że wszystkie kinazy deoksyrybonukleozydowe (lub precyzyjniej, aktywności tych enzymów) mogą być przyporządkowane do dwóch grup: (a) TK1, TK2, dNK i dCK (ale tylko z dAdo jako akceptorem), z restrykcyjną specyficznością wobec donorów fosforanu, są aktywne tylko wobec 2'-trifosforanu 3'-deoksyadenosyny; (b) dCK (z dCyd jako akceptorem) i dGK, ze zrelaksowaną specyficznością, które akceptują wszystkie 3'(2')-trifosforany 2'(3')- deoksyadenozyny i ich analogi (Krawiec i wsp., 1998, 2003) oraz tripolyfosforan (Krawiec i wsp., 2003) na poziomie porównywalnym lub przewyższającym aktywność wobec ATP.

Ponadto pokazaliśmy, że oddziaływania enzymu z donorami fosforanu zależą od akceptorów, co wraz z szeroką specyficznością substratową pokazuje istotne cechy charakterystyczne mechanizmu funkcjonowania tych enzymów in vivo.

Projekt C: Mechanizm działania membran tylakoidowych w roślinach wyższych

Badania tego zagadnienia prowadzimy za pomocą spektroskopii absorpcyjnej, fluorescencyjnej, CD i mikroskopii konfokalnej, przy różnych stężeniach jonów magnezu i detergentów, które wpływają na widma chloroplastów i wydajność kwantową procesów fotosyntezy. Pomiary wykonujemy przy różnej (kontrolowanej) zawartości tlenu cząsteczkowego, którego stężenie kontrolujemy za pomocą azotu (argonu) lub poprzez enzymatyczny rozkład w roztworach. Dotychczas otrzymane wyniki interpretujemy za pomocą hipotezy o możliwym wpływie magnesu i detergentów na strukturę membran, szczególnie wyraźnie odzwierciedlonym w zmianach rezonansowego transferu energii (RET), który mierzymy za pomocą porównania względnych zmian natężenia pasm w widmach emisji (650-750 nm) i wzbudzenia (400-520 nm) fluorescencji.

Wybrane publikacje

  1. Włodarczyk J. and Kierdaszuk B., Interpretation of fluorescence decays using a power-like model. Biophysical Journal, 85(1), in press (2003)
  2. Krawiec K., Kierdaszuk B. and Shugar D., Inorganic tripolyphosphate (PPPi) as a phosphate donor for human deoxyribonucleoside kinases. Biochemical and Biophysical Research Communications 301, 192-197 (2003)
  3. Poznański J., Kierdaszuk B. and Shugar D., Structural properties of the neutral and monoanioic forms of xanthosine, highly relevant to their substrate properties with various enzyme systems. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22, 249-263 (2003)
  4. Krawiec K., Kierdaszuk B., Kalinichenko E. N., Rubinova E. B., Mikhailopulo I. A., Eriksson S., Munch-Petersen B. and Shugar D., Striking ability of adenosine-2'(3')-deoxy-3'(2')-triphosphates, and related analogues, to replace ATP as phosphate donor for all human, and Drosphila melanogaster, deoxyribonucleoside kinases. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22, 153-173 (2003)
  5. Kierdaszuk B., Emission spectroscopy of complex formation between Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase (PNP) and identified tautomeric species of formycin inhibitors resolves ambiguities found in crystallographic studies. Fluorescence Spectroscopy, Imaging and Probes 2, 277-296 (2002)
  6. Stoychev G., Kierdaszuk B. and Shugar D., Xanthosine and xanthine: Substrate properties with purine nucleoside phosphorylases, and relevance to other enzyme systems. European Journal of Biochemistry 269, 4048-4057 (2002)
  7. Stoychev G., Kierdaszuk B. and Shugar D., Interaction of E. coli purine nucleoside phosphorylase (PNP) with the cationic and zwitterionic forms of the fluorescent substrate N(7)-methylguanosine. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology, 1544, 74-88 (2001)
  8. Kierdaszuk B., Modrak-Wójcik A., Wierzchowski J. and Shugar D., Formycin A and its N-methyl analogues, specific inhibitors of E. coli purine nucleoside phosphorylase (PNP): induced tautomeric shifts on binding to enzyme, and enzyme-ligand fluorescence resonance energy transfer. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology 1476, 109-128 (2000)
  9. Stepanenko T., Lapinski L., Sobolewski A.L., Nowak M.J. and Kierdaszuk B., Photochemical syn-anti isomerisation reaction in 1-methyl-N4-hydroxycytosine. An experimental matrix isolation and theoretical density functional theory study. Journal of Physical Chemistry, 104, 9459-9466 (2000)
  10. Kierdaszuk B., Krawiec K., Kazimierczuk Z., Jacobsson U., Johansson N.G., Munch Petersen B., Eriksson S. and Shugar D., Substrate/inhibitor specificities of human deoxycytidine kinase (dCK) and thymidine kinase (TK1 and TK2) towards the sugar moiety of nucleosides, including O'-alkyl analogues. Nucleosides & Nucleotides 18, 1883-1903 (1999)
  11. Kierdaszuk B., Krawiec K., Kazimierczuk Z., Jacobsson U., Johansson N.G., Munch-Petersen B., Eriksson S. and Shugar D., Substrate/inhibitor specificities of human deoxycytidine kinase (dCK) and thymidine kinase (TK1 and TK2). Advances in Experimental Medicine and Biology 431, 623-627 (1998)
  12. Niedzwiecka-Kornas A., Kierdaszuk B., Stolarski R. and Shugar D. Tautomerism, acid-base properties and conformation of methylated analogues of the promutagenic N4-hydroxycytosine. Biophysical Chemistry 71, 87-98 (1998)
  13. Krawiec K., Kierdaszuk B., Kalinichenko E.N., Mikhailopulo I.A. and Shugar D., Unusual nucleoside triphosphate donors for nucleoside kinases: 3'-deoxyadenosine-2'-triphosphate and 2'-deoxyadenosine-3'-triphosphate. Acta Biochimica Polonica 45, 87-94 (1998)
  14. Wieczorek Z., Zdanowski K., Chlebicka L., Stępiński J., Jankowska M., Kierdaszuk B., Temeriusz A., Darżynkiewicz E. and Stolarski R., Fluorescence and NMR studies of intramolecular stacking of mRNA cap-analogues. Biochimica et Biophysica Acta 1354, 145-152 (1997)
  15. Kierdaszuk B., Gryczynski I. and Lakowicz J.R., Two-photon induced fluorescence of proteins. In Topics in Fluorescence Spectroscopy, Volume 5: Nonlinear and Two-Photon-Induced Fluorescence, (Lakowicz, J. Ed.) New York: Plenum Publishing Co., pp. 187-209 (1997)
  16. Kierdaszuk B., Modrak-Wojcik A. and Shugar D., Binding of phosphate and sulfate anions by purine nucleoside phosphorylase from E. coli: Ligand-dependent quenching of enzyme intrinsic fluorescence. Biophysical Chemistry 63, 107-118 (1997)
  17. Birnbaum K., Kierdaszuk B. and Shugar D., Crystal structure of 1,3,5-trimethyl-N4-hydroxycytosine, and its relevance to the mechanism of hydroxylamine mutagenesis. Nucleosides & Nucleotides 15, 1805-1819 (1996)
  18. Kierdaszuk B., Malak H. Gryczynski I., Calis P. and Lakowicz J.R., Fluorescence of reduced nicotinamides using one- and two-photon excitation. Biophysical Chemistry 62, 1-13 (1996)
  19. Lakowicz J.R., Kierdaszuk B., Malak H. and Gryczynski I., Fluorescence of horse liver alcohol dehydrogenase using one- and two-photon excitation. Journal of Fluorescence 6, 51-59 (1996)
  20. Lakowicz J.R., Kierdaszuk B., Calis P., Malak H. and Gryczynski I., Fluorescence anisotropy of tyrosine using one- and two-photon excitation. Biophysical Chemistry 56, 263-271 (1995)
  21. Krawiec K., Kierdaszuk B., Eriksson S., Munch-Petersen B. and Shugar D., Nucleoside triphosphate donors for nucleoside kinases: donor properties of UTP with human deoxycytidine kinase. Biochemical and Biophysical Research Communications 216, 42-48 (1995)
  22. Krawiec K., Kierdaszuk B. and Shugar D., 5'-Substituted 2'-Deoxycytidine as non-substrate Inhibitors of human deoxycytidine kinase. Nucleosides & Nucleotides 14, 495-499 (1995)
  23. Bretner M., Balinska M., Krawiec K., Kierdaszuk B., Shugar D. and Kulikowski T., Synthesis and Biological Activity of 5-Fluoro-2-thiocytosine Nucleosides. Nucleosides & Nucleotides 14, 657-660 (1995)
  24. Kierdaszuk B., Gryczynski I., Modrak-Wojcik A., Bzowska A., Shugar D. and Lakowicz J.R., Fluorescence of tyrosine and tryptophan in proteins using one- and two-photon excitation. Photochemistry and Photobiology 61, 319-324 (1995)

Finansowanie

Komitet Badań Naukowych (KBN): 3 projekty badawcze w latach 1992-2000

Howard Hughes Medical Institute (USA): 5-letni grant badawczy

Współpraca międzynarodowa: 2 projekty badawcze współpracy naukowej z zagranicą, współpartnerzy zagraniczni: Prof. Birgitte Munch-Petersen i Prof. Gert Dandanell (Dania) oraz Prof. Rudolf Rigler i Prof. Staffan Eriksson (Szwecja)

European Science Foundation: uczestnictwo w ogólnoeuropejskim projekcie badawczym "Femtochemistry and femtobiology ULTRA"