Rola końców 5' mRNA i 5' U snRNA (tzw. struktur kapu) w regulacji ekspresji genu

Udział MMG kapu (m7GpppN) w tworzeniu rybosomalnego kompleksu inicjacyjnego 48S.
Kap rozpoznawany jest bezpośrednio przez eukariotyczny czynnik inicjacyjny 4E (eIF4E), który wiąże się z N-końcowym fragmentem wielofunkcyjnego białka eIF4G. Na C-końcu eIF4G znajduje się miejsce wiążące kinazę Mnk1 odpowiedzialną za fosforylację eIF4E na serynie 209. Aktywność eIF4E jest inhibowana poprzez ograniczenie jego dostępności dla eIF4G przez specyficzne białka 4E-BP (4E-Binding Proteins) blokujące miejsce wiążące eIF4G na zasadzie molekularnej mimikry. Białka 4E-BP podlegają własnej regulacji poprzez kaskadową hiperfosforylację. Czynnik eIF4G służy jako "rusztowanie", którego N-koniec oddziałuje z PABP (ang. PolyA Binding Protein), białkiem mającym powinowactwo do poliadenylowego odcinka na końcu 3' mRNA, co powoduje zbliżenie obu końców mRNA i utworzenie struktury zapętlonej. Środkowy odcinek eIF4G wiąże się z czynnikiem eIF3, a C-koniec z czynnikiem eIF4A, będącym helikazą zależną od ATP, odpowiedzialną za rozplątanie końca 5' mRNA nieulegającego translacji (5' UTR). W ten sposób preinicjacyjny kompleks rybosomalny 43S (tj. podjednostka rybosomalna 40S + metionylo-tRNA + eIF2 + eIF3) rozpoczyna scanningową migrację do kodonu inicjatorowego AUG.

Osoby zaangażowane w projekt
Edward Darżynkiewicz
Janusz Stępiński
Jacek Jemielity
Joanna Żuberek
Ewa Grudzień
Katarzyna Kiraga-Motoszko
Magdalena Lewdorowicz
Dorota Haber
Marcin Kałek
Joanna Kowalska

Współpraca w Zakładzie Biofizyki
Ryszard Stolarski
Jan Antosiewicz
Michał Dadlez

Współpraca krajowa
Marzena Jankowska-Anyszka, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
Zbigniew Wieczorek, Uniwersytet Warmińsko - Mazurski, Olsztyn
Andrzej Guranowski, Akademia Rolnicza, Poznań
Zbigniew Jedliński, Centrum Chemii Polimerów PAN, Zabrze
Ryszard Kierzek, Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań

Współpraca zagraniczna
Robert Rhoads, Louisiana State University, Shreveport, USA
Richard Davies, City University of New York, New York, USA
Nahum Sonenberg, McGill University, Montreal, Canada
Harri Lőnberg, University of Turku, Turku, Finland
Michal Shapira, Ben Gurion University of The Negev, Israel
Iain Mattaj, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany
Stephen Cusack, European Molecular Biology Laboratory, Grenoble, France

Słowa kluczowe
5' mRNA cap, (monometyloguanozyno kap; m7GpppG; MMG kap)
Eukariotic Initiation Factor 4E (eIF4E)
Cap Binding Complex (CBC)
m32,2,7GpppN (trimetyloguanozyno kap; TMG kap)
U snRNA (małe jądrowe RNA)
Translacja
Splicing

Opis projektu

Eukariotyczny mRNA posiada na swoim końcu 5' specyficzną strukturę, tzw. kap (ang. "cap"). Jest to 7-metyloguanozyna połączona nietypowym dla kwasów nukleinowych wiązaniem 5',5' trifosforanowym z następnym nukleozydem, który często jest zmetylowany na grupie 2'-hydroksylowej w pierścieniu rybofuranozowym. Strukturę tego kapu przedstawia się skrótowo jako m7GpppN lub MMG-kap (monometyloguanozyno kap). U nicieni, obok mRNA zakończonych MMG-kapem, znaczna część mRNA posiada na swoim końcu tzw. trimetyloguanozyno kap TMG-kap), w którym 5'-końcowym nukleozydem jest 2,2,7-trimetyloguanozyna (m32,2,7GpppN). TMG-kap występuje również na końcach 5' większości małych jądrowych RNA bogatych w urydynę (U snRNA).

MMG-kap w mRNA pełni podstawową funkcję w procesie inicjacji biosyntezy białka (translacji). Rozpoznawany jest on przez eukariotyczny faktor białkowy eIF4E, co stanowi sygnał do utworzenia translacyjnego kompleksu inicjacyjnego, złożonego z mRNA, szeregu dodatkowych faktorów białkowych oraz małej podjednostki rybosomalnej 40S (schemat). MMG kap pełni też rolę stymulującą w procesie splicingu pre-mRNA. Szersze omówienie roli biologicznej kapu można znaleźć w pracy przeglądowej (13).

Zespół tworzący Laboratorium Ekspresji Genu zajmuje się syntezą zarówno naturalnych jak też zmodyfikowanych chemicznie analogów kapu oraz ich szerokim zastosowaniem w badaniach biochemicznych i biofizycznych nad molekularnymi mechanizmami regulacji ekspresji genu. Ukierunkowane modyfikacje chemiczne na obu zasadach nukleinowych, w pierścieniach cukrowych oraz w łańcuchu fosforanowym, dostarczyły ponad stu modelowych analogów, z których wiele wprowadzonych do systemu translacyjnego in vitro konkuruje z mRNA o miejsce wiązania przez eIF4E hamując w ten sposób proces biosyntezy białka. Badania inhibicji translacji przez analogi kapu pozwoliły na zdefiniowanie szeregu parametrów strukturalnych kapu odpowiedzialnych za wiązanie się z faktorem eIF4E (patrz np. 1-3,11). Jako pierwsi otrzymaliśmy na drodze syntetycznej m. in. TMG-kap (m32,2,7GpppN) i jego analogi (3), które to związki przyczyniły się do ustalenia sygnalnej roli TMG-kapu w imporcie dojądrowym U snRNA (4,5), a także do odkrycia i wstępnej charakterystyki pięciu izoform faktora eIF4E w nicieniach C.elegans (10,16,17). Inne zastosowanie syntetycznych analogów MMG-kapu pozwoliło na pełniejszą identyfikację jądrowego kompleksu białkowego wiążącego kap (CBC) i wykazanie jego stymulującej roli w splicingu pre mRNA (6,7). Aktualnie prowadzimy w ścisłej kooperacji z zespołem Prof. Stolarskiego badania nad specyficznością oddziaływania zarówno izoformicznych odmian faktora eIF4E z C.elegans, jak też CBC, z modelowymi analogami kapu. Badania te mają na celu identyfikację miejsc wiążących struktury kapu przez poszczególne białka. Ostatnio zsyntetyzowaliśmy tzw. ARCAs ("Anti Reverse Cap Analogues") - dinukleotydowe analogi kapu z zablokowaną grupą 3'-hydroksylową w 7-metyloguanozynie (np.: m73'OMeGpppG). Analogi te, dzięki wyłącznie prawidłowemu wbudowywaniu do łańcucha RNA w reakcji z udziałem bakteriofagowych polimeraz RNA II, znalazły zastosowanie przy otrzymywaniu syntetycznych transkryptów RNA (14). mRNA zakończone ARCA okazały się około dwukrotnie efektywniejszymi matrycami w syntezie białka w porównaniu z mRNA zakończonym tradycyjnym kapem (14). Oprócz syntez analogów kapu, otrzymujemy na drodze inżynierii genetycznej niezbędne do badań biofizycznych faktory białkowe, zarówno "wild type", jak też ich mutanty (patrz np. 21).

Badania biofizyczne oddziaływań analogów kapu ze specyficznymi faktorami białkowymi, uczestniczącymi na różnych poziomach regulacji ekspresji genu (translacja, splicing, transport wewnątrzkomórkowy RNA) prowadzone są w ścisłej współpracy z laboratorium prof. R. Stolarskiego i prof. J. Antosiewicza, natomiast część badań biologicznych prowadzona jest w ramach szeroko zakrojonych współprac krajowych i zagranicznych. Reprezentowane przez nasz zespół interdyscyplinarne podejście, angażujące zarówno chemików, jak też biochemików oraz biofizyków, stwarza unikalne możliwości wnikliwego zbadania niektórych mechanizmów regulacji ekspresji genu na poziomie molekularnym. Od niedawna dysponujemy kilkoma dobrze wyposażonymi laboratoriami chemicznymi i biochemicznymi, w których wykonywane są również prace magisterskie i doktorskie z zakresu syntezy chemicznej i biochemii. Jesteśmy otwarci, i cieszymy się z udziału w tych badaniach nie tylko magistrantów i doktorantów, ale też studentów z młodszych lat z Wydziałów: Chemii, Biologii oraz MISMaP. Zamierzamy w dalszym ciągu rozszerzać podejście interdyscyplinarne mając świadomość, iż na styku różnych dziedzin wiedzy powstają najciekawsze odkrycia naukowe.

Aktualne plany badawcze obejmują m. in. następujące zadania

  • chemiczna synteza oligonukleotydów zakończonych strukturą kapu (m. in. tetranukleotydowy analog końca 5' mRNA występujący w Leishmanii)
  • synteza analogów kapu o zwiększonej odporności na hydrolizę chemiczną i enzymatyczną, a następnie otrzymanie transkryptów RNA z wbudowanymi w/w analogami na ich końcu 5'.
  • synteza bardziej efektywnych analogów kapu typu ARCA
  • rozwijanie metodologii syntezy dinukleozydów połączonych łańcuchem 5',5'-oligofosforanowym
  • synteza analogów kapu zdolnych do przenikania przez błonę komórkową, jako potencjalnych środków przeciwnowotworowych.

Wybrane publikacje

  1. Darżynkiewicz E., Stępiński J., Ekiel I., Jin Y., Haber D., Sijuwade T., Tahara S.M., "ß-Globin mRNAs Capped with m7G, m2,7G or m2,2,7G Differ in Intrinsic Translation Efficiency" (1988), Nucleic Acids Res. 16, 8953-8962.
  2. Darżynkiewicz E., Stępiński J., Ekiel I., Goyer C., Sonenberg N., Temeriusz A., Jin Y., Sijuwade T., Haber D., Tahara S.M., "Inhibition of Eukaryotic Translation by Nucleoside 5'-Monophosphate Analogues of mRNA 5'-Cap: Changes in N7 Substituent Affect Analogue Activity" (1989), Biochemistry 28, 4771-4778.
  3. Darżynkiewicz E., Stępiński J., Tahara S. M., Stolarski R., Ekiel I., Haber D., Neuvonen K., Lehikoinen P., Labadi I., Lönnberg H., "Synthesis, Conformation and Hydrolytic Stability of P1, P3-dinucleoside Triphosphates Related to mRNA 5'-Cap, and Comparative Kinetic Studies on Their Nucleoside and Nucleoside Monophosphate Analogs" (1990), Nucleosides & Nucleotides 9, 599-618.
  4. Hamm J., Darżynkiewicz E., Tahara S. M., Mattaj I. W., "The Trimethylguanosine Cap Structure of U1 snRNA Is a Component of a Bipartite Nuclear Targeting Signal" (1990), Cell 62, 569-577.
  5. Fischer U., Darżynkiewicz E., Tahara S. M., Dathan N. A., Lührmann R., Mattaj I. W., "Diversity in the Signals Required for Nuclear Accumulation of U snRNPs and Variety in the Pathways of Nuclear Transport" (1991), J. Cell Biol. 113, 705-714.
  6. Izaurralde E., Stępiński J., Darżynkiewicz E., Mattaj I. W., "A Cap Binding Protein That May Mediate Nuclear Export of RNA Polymerase II-transcribed RNAs" (1992), J. Cell. Biol. 118, 1287-1295.
  7. Izaurralde E., Lewis J., McGuigan C., Jankowska M., Darżynkiewicz E., Mattaj I.W., "A Nuclear Cap Binding Protein Complex Involved in Pre-mRNA Splicing" (1994), Cell. 78, 657-668.
  8. Maroney P.A., Denker J.A., Darżynkiewicz E., Laneve R., Nilsen T.W., "Most mRNA in the Nematode Ascaris lumbricoides Are trans-spliced: A Role for Spliced Leader Addition in Translational Efficiency" (1995), RNA, 1, 714-723.
  9. Joshi B., Cai A-L., Keiper B. D., Minich W. M., Mendez R., Beach C. M., Stępiński J., Stolarski R., Darżynkiewicz E., Rhoads R. E, "Phosphorylation of Eukaryotic Protein Synthesis Initiation Factor 4E at Ser-209" (1995), J. Biol. Chem., 270, 14597-14603.
  10. Jankowska-Anyszka M., Lamphear B. J., Aamodt E. J., Harrington T., Darżynkiewicz E., Stolarski R., Rhoads R.E., "Multiple Isoforms of Eukaryotic Protein Synthesis Initiation Faktor 4E in Caenorhabditis elegans Can Distinguish between Mono- and Trimethylated mRNA Cap Structures" (1998), J. Biol. Chem. 273, 10538-10542.
  11. Cai A., Jankowska-Anyszka M., Centers A., Chlebicka L., Stępiński J., Stolarski R., Darżynkiewicz E., Rhoads R. E., "Quantitative Assessment of mRNA Cap Analogs as Inhibitors of Cell-Free Translation" (1999), Biochemistry, 38, 8538-8547.
  12. Lampio A., Ahola T., Darżynkiewicz E., Stępiński J., Jankowska-Anyszka M., Kaariainen L., "Guanosine Nucleotide Analogs as Inhibitors of Alphavirus mRNA Capping Enzyme" (1999), Antivirial Res., 42, 35-46.
  13. M. Jankowska-Anyszka, E. Darżynkiewicz: "Struktura i funkcja końca 5' (kapu) mRNA i U snRNA", Tom IV, str. 143-180, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań, 2000.
  14. Stępiński J., Waddell C., Stolarski R., Darżynkiewicz E., Rhoads R.E.: "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl-(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl-(3'-deoxy)GpppG", RNA 7 (2001) 1486-1495.
  15. Niedźwiecka A., Marcotrigiano J., Stępiński J., Jankowska-Anyszka M., Wysłouch-Cieszyńska A., Dadlez M., Gingras A-C., Mak P., Darżynkiewicz E., Sonenberg N., Burley S.K., Stolarski R.: "Biophysical Studies of eIF4E Cap-binding Protein: Recognition of mRNA 5' Cap Structure and Synthetic Fragments of eIF4G and 4E-BP1 Proteins", J. Mol. Biol. 319 (2002) 615-635.
  16. H. Miyoshi, D.S. Dwyer, B. D. Keiper, M. Jankowska-Anyszka, E. Darżynkiewicz, R.E. Rhoads: "Discrimination between mono- and trimethylated cap structures by two isoforms of Caenorhabditis elegans eIF4E", EMBO J. 21 (2002) 4680-4690.
  17. A. Stachelska, Z. Wieczorek, K. Ruszczyńska, R. Stolarski, M. Pietrzak, B. J. Lamphear, R. E. Rhoads, E. Darżynkiewicz, M. Jankowska-Anyszka: "Interaction of three Caenorhabditis elegans isoforms of translation initiation factor eIF4E with mono- and trimethylated mRNA 5' cap analogues", Acta Biochim. Pol. 49 (2002) 671-682.
  18. A. Niedźwiecka, J. Stępiński, E. Darżynkiewicz, N. Sonenberg, R. Stolarski: "Positive heat capacity change upon specific binding of translation itiation factor eIF4E to mRNA 5' cap", Biochemistry 41 (2002) 12140-12148.
  19. J. Stępiński, M. Jankowska-Anyszka, E. Darżynkiewicz: "Synteza ważnych biologicznie dinukleotydów z wiązaniem 5',5'-oligofosforanowym", w "Na pograniczu chemii i biologii", Tom V, str. 105-138, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań, 2002.
  20. E. Bojarska, E. Darżynkiewicz: "Molekularne mechanizmy degradacji mRNA w komórkach eukariotycznych", w "Na pograniczu chemii i biologii", Tom V, str. 53-72, Wydawnictwo Naukowe UAM, Poznań, 2002.
  21. J. Żuberek, A. Wysłouch-Cieszyńska, A. Niedźwiecka, M. Dadlez, J. Stępiński, W. Augustyniak, A.-Cl. Gingras, Z. Zhang, S. K. Burley, N. Sonenberg, R. Stolarski, E. Darżynkiewicz: "Phosphorylation of eIF4E attenuates its interaction with mRNA 5' cap analogs by electrostatic repulsion: Intein-mediated protein ligation strategy to obtain phosphorylated protein", RNA 9 (2003) 52-61.

Finansowanie

GRANT International Research Scholars Program, HHMI #55005604 pt. "Synthetic 5' mRNA Cap Analogues: Tools to Search for Gene-Regulatory Mechanisms" (2006-2010)

GRANT MNiI 2 P04A 006 28 pt. "Struktura i funkcja kapu-4 u wczesnych eukariotów - trypanosomatydów, jego chemiczne analogi jako potencjalne leki przeciwko Leishmanii" (2005 - 2008)

Grant PBZ-KBN 059/T09/10 pt.: "Synteza mono-, di-, tetra- i oligonukleotydowych analogów końca 5' mRNA jako potencjalnych środków terapeutycznych oraz narzędzi badawczych w biologii molekularnej" (2001-2005)