Struktura przestrzenna i molekularny mechanizm katalizy białek z rodziny fosforylaz nukleozydów purynowych

Krystalograficzna struktura fosforylazy nukleozydow purynowych z Cellulomonas
w kompleksie z fosforanem i 8-J-guaniną

Osoby zaangażowane w projekt
Agnieszka Bzowska
Beata Wielgus-Kutrowska
Marta Narczyk

Współpraca w Zakładzie Biofizyki
Jan Antosiewicz
Anna Modrak-Wójcik

Słowa kluczowe

fosforylazy nukleozydów purynowych

mechanizm katalizy

struktura przestrzenna

kinetyka

krystalografia

analityczne ultrawirowanie

spektroskopia

Helicobacter pylori

Opis realizowanych projektów

Enzymy katalizują prawie wszystkie reakcje chemiczne zachodzące w organizmach żywych. Poznanie struktury trójwymiarowej enzymów z rozdzielczością atomową, a także molekularnego mechanizmu katalizy i oddziaływania z ligandami, jest nie tylko pasjonującym problemem naukowym, ale w przypadku wielu enzymów, na przykład pochodzących z organizmów patogennych, ma istotny aspekt praktyczny. Do takich enzymów należą fosforylazy nukleozydów purynowych, których silne selektywne inhibitory są potencjalnymi lekami np. immunosupresyjnymi (ewentualne zastosowanie  przy transplantacji narządów lub w terapii białaczek), a różnice w specyficzności enzymów należących do tej rodziny, pochodzących z różnych organizmów, np. człowieka i bakterii, mogą być wykorzystane w terapii genowej niektórych nowotworów i w zwalczaniu mikroorganizmów chorobotwórczych (zobacz Bzowska et al., 2000). Celem naszym jest poznanie struktury i mechanizmu działania enzymów należących do tej rodziny, a także w niektórych przypadkach innych  pokrewnych enzymów należących do tzw. drogi ratunkowej (zapasowej) komórki, przy zastosowaniu metod dyfraktometrycznych, kinetycznych, spektroskopowych, analitycznego ultrawirowania, kalorymetrycznych i innych nowoczesnych metod biofizyki molekularnej. Obecnie realizujemy dwa projekty.

Enzymy drogi zapasowej (ratunkowej) komórki jako cel terapii przeciw organizmom chorobotwórczym pozbawionym możliwości syntezy puryn de novo - na przykładzie Helicobacter pylori

Życie wszystkich organizmów zależy od syntezy cząsteczki kwasów nukleinowych, DNA i RNA. Puryny i nukleozydy purynowe są niezbędnymi elementami budulcowymi do syntezy tych kwasów. Szereg organizmów chorobotwórczych nie może syntetyzować puryn i nukleozydów purynowych de novo. Może uzyskać je tylko z recyklingu odpadów metabolicznych, konkretnie ze szlaku metabolicznego nazywanego drogą ratunkową (zapasową) komórki (Hyde, 2007; Tan et al., 2009). Celem projektu jest poznanie molekularnego mechanizmu działania przynajmniej dwóch kluczowych enzymów tego szlaku, w tym fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) z bakterii Helicobacter pylori, groźnego patogenu człowieka (Marshall i Warren, 1984; Makola et al., 2007, Go, 2002; Dzierżanowska-Fangrat et al., 2005; M. Katičić, 2006), zidentyfikowanie związków hamujących ich działanie (inhibitorów) i sprawdzenie czy hamowanie działania tych białek może doprowadzić do zahamowania rozwoju bakterii. Nasze badania wstępne pokazują, że hamowanie enzymu PNP spowalnia namnażanie się bakterii, jednak aby zatrzymać rozwój bakterii niezbędne są dalsze badania w celu znalezienia związku silniej hamującego enzym PNP oraz jednoczesne hamowanie przynajmniej jeszcze jednego z enzymów tego szlaku (Licheti i Goldberg, 2012).

W celu określenia molekularnego mechanizmu działania wybranych enzymów należących do szlaku zapasowego (ratunkowego) bakterii H. pylori, planujemy uzyskanie ich rekombinowanych próbek metodami inżynierii genetycznej, wyznaczenie ich struktury przestrzennej, z atomową rozdzielczością metodami dyfrakcyjnymi, zbadanie właściwości enzymów w roztworze metodami biochemicznymi i zaawansowanymi metodami biofizyki molekularnej. Jednocześnie sprawdzone zostanie czy znane inhibitory tych enzymów izolowanych z innych organizmów (np. z E. coli) hamują także białka z H. pylori. Następnie w oparciu o wyniki obu podejść, zostanie podjęta próba zaprojektowania i zsyntetyzowania silnych, specyficznych inhibitorów enzymów  z H. pylori.

Nie jest dostępna szczepionka przeciw infekcji H. pylori, a dotychczas stosowane terapie, tzw. potrójna czy sekwencyjna (oparte na zastosowaniu inhibitora enzymu tzw. pompy protonowej i przynajmniej dwóch antybiotyków) nie zawsze są skuteczne z powodu braku podatności na kurację niektórych pacjentów i oporności na antybiotyki szeregu szczepów H. pylori (Ruggiero, 2012). Zatem bardzo potrzebne są nowe podejścia w leczeniu infekcji H. pylori. Opisany tu projekt poświęcony jest badaniom podstawowym weryfikującym na poziomie molekularnym czy hamowanie rozwoju H. pylori poprzez hamowanie enzymów szlaku ratunkowego tej bakterii ma szansę na późniejszą praktyczną realizację.

Proponowane interdyscyplinarne badania wymagają udziału specjalistów z wielu rożnych często bardzo zaawansowanych dziedzin badawczych od inżynierii genetycznej, przez chemię organiczną i eksperymentalne metody biofizyki molekularnej, po zaawansowane metody obliczeniowe, posiadających ponadto niezbędne doświadczenie w prowadzeniu badań na podobnych obiektach biologicznych. Dlatego tez projekt realizowany jest we współpracy z grupa badawczą Prof. Mariji Luić z Rudjer Boskovic Instititute (Zagrzeb, Chrowacja),  Dr Branimira Bertosy z Uniwersytetu w Zagrzebiu, a także grupą prof. Katarzyny Jagusztyn-Krynickiej z Wydziału Biologii UW. Zespoły badawcze uzupełniają się, jeśli chodzi o specjalistów w wymaganych do realizacji projektu dziedzinach.

Finansowanie

Grant Harmonia Narodowego Centrum Nauki (2016-2019) „Enzymy drogi zapasowej (ratunkowej) komórki jako cel terapii przeciw organizmom chorobotwórczym pozbawionym możliwości syntezy puryn de novo - na przykładzie bakterii Helicobacter pylori” (kierownik projektu  prof. Maria Agnieszka Bzowska

Czteroletni grant Croatian Science Foundation (2013-2018) „Purine salvage pathway enzymes from Helicobacter pylori and Escherichia coli” (kierownik projektu - prof. Marija Luic, koordynator badań prowadzonych w Polsce – prof. Maria Agnieszka Bzowska)

Literatura

  1. Dzierżanowska-Fangrat, E. Rożynek , D. Celińska-Cedro et al., Antimicrobial resistance of Helicobacter pylori in Poland: a multicenter study. Int. J. Antimicrob. Agents 26, 230–234 (2005).

M.F. Go, Review article: natural history and epidemiology of Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther. 10, 3–15, (2002).

J.E. Hyde, Targeting purine and pyrimidine metabolism in human apicomplexan parasites. Curr. Drug. Targets.8, 31–47 (2007).

  1. Katičić, Peptic Ulcer Disease. Medicus. 15, 39–52, (2006).
  2. Liechti, J.B. Goldberg, Helicobacter pylori relies primarily on the purine salvage pathway for purine nucleotide biosynthesis J. Bacteriol. 194, 839–854, (2012).
  3. Makola, D.A. Peura, S.E. Crowe, Helicobacter pylori infection and related gastrointestinal diseases. J. Clin. Gastroenterol. 41, 548–558 (2007).

B.J. Marshall, J.R. Warren. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet. 1 (8390), 1311-1315 (1984).

  1. Ruggiero, Helicobacter pylori infection: what’s new. Curr. Opin. Infect, Dis. 25, 337-344 (2012).
  2. Tan, L.S. Tompkins, M.R. Amieva, Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PloS Pathog. 5, e1000407 (2009).

J.F. Tomb, O. White, A.R. Kerlavage et al., The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori, Nature 388, 539-547 (1997).

Wybrane publikacje powstałe w wyniku realizacji projektu

  1. Stefanic, G. Mikleusevic, M. Luic, A. Bzowska, I. Lescic –Asler, Structural characterization of purine nucleoside phosphorylase from human pathogen Helicobacter pylori, Int. J. Biol. Macromol. 101, 518–526 (2017)

 

Enzymy homooligomeryczne o bardzo silnej (nieskończonej) negatywnej kooperacji w wiązaniu ligandów i katalizie: czy natura jest rozrzutna?

Znacząca ilość białek to homooligomery zbudowane z kilku łańcuchów polipeptydowych o tej samej sekwencji aminokwasowej. Kooperatywne wiązanie ligandów przez takie białka jest procesem szeroko spotykanym, aczkolwiek kooperacja pozytywna występuje zdecydowanie częściej niż negatywna. Wydaje się, że nie ma w tym nic dziwnego, gdyż silniejsze wiązanie kolejnych ligandów to wygodny mechanizm regulacyjny zmuszający dane białko do wydajniejszej pracy, gdy pojawia się więcej molekuł ligandu do obróbki. Tymczasem kooperacja negatywna na pierwszy rzut oka może być oceniona jako proces destrukcyjny: każda kolejna molekuła ligandu wiązana jest słabiej. Co więcej, w pewnych pracach pokazano (np. Mulvey and Fersht, 1976, Anderson et al., 1999; Shi et al. 2006), że kooperacje negatywna jest tak silna, iż dochodzi, w przypadku dimerów, do tzw. .half-the-sites binding. (lub także half-the-sites reactivity, gdy białko wykazuje aktywność enzymatyczną) czy też do part-the-sites binding (reactivity) w przypadku wyższych hoomoligomerów. Logicznym wydaje się w tej sytuacji postawienie pytania, dlaczego białka takie zbudowane są z kilku łańcuchów polipeptydowych o tej samej sekwencji, skoro tylko jedna podjednostka wiąże ligand (katalizuje reakcje enzymatyczną).

Pytanie to nasunęło się nam w trakcie naszych wieloletnich prac zmierzających do określenia mechanizmu katalizy prowadzonej przez rodzinę białek - fosforylaz nukleozydów purynowych, ważnych enzymów targetowych w terapii chorób nowotworowych i chorób układu immunologicznego. Fosforylazy ze ssaków i niektórych innych organizmów są homotrimerami, natomiast szereg fosforylaz bakteryjnych to homoheksamery (Bzowska et al., 2000). Prace nasze (np. Koellner et al. 2002), a także równoległe prace prowadzone przez inne zespoły badawcze (np Kierdaszuk et al., 1997) wykazały, że fosforylazy heksameryczne to strukturalnie trimery dimerów; w dimerze jedna podjednostka z dwóch charakteryzuje się zamkniętą konformacją miejsca aktywnego po związaniu ligandu i ligand wiązany jest przez nią silnie, natomiast miejsce aktywne drugiej pozostaje otwarte i ligand wiązany jest o rzędy wielkości słabiej. Podobny mechanizm pokazano też dla kilku innych enzymów (np. Leslie 1984; Norager et al., 2003). Jednak nasze najnowsze prace sugerują, że także dimery komunikują się ze sobą i nie działają symetrycznie [Mikleusevic et al., 2010; Stefanic et al., 2012]. W realizowanym projekcie pragniemy odpowiedzieć miedzy innymi na pytanie jak powszechny jest mechanizm "part-the-sites binding (reactivity)",  czy trimery dimerów składające się na heksameryczna molekułę fosforylazy działają niezależnie, czy w przypadku fosforylaz, a także innych białek wykazujących zjawisko "part-the-sites binding (reactivity)" wspomniany mechanizm przynosi jakąś korzyść. Niedawno udowodniliśmy, że dimery PNP z E. coli i monomery PNP ssaczego są niestabilne i jako samodzielne molekuły nie byłyby zdolne do prowadzenia katalizy [Bertosa et al., 2014; A.Dyzma, B.Wielgus-Kutrowska, J.Trylska, A.Bzowska, praca w przygotowaniu].

Projekt do 2015 roku był finansowany z grantu przyznanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego "Enzymy homooligomeryczne o bardzo silnej (nieskończonej) negatywnej kooperacji w wiązaniu ligandów i katalizie: czy natura jest rozrzutna?" (kierownik prof. Agnieszka Bzowska), a obecnie jest finansowany z dotacji na badania statutowe UW.

Literatura

Anderson AC, O'Neil RH, DeLano WL, Stroud RM (1999) The structural mechanism for half-the-sites reactivity in an enzyme, thymidylate synthase, involves a relay of changes between subunits. Biochem. 38, 13829-13836.

Bertosa, B. Mikleusevic, G. Wielgus-Kutrowska, B. Narczyk, M. Hajnic, M. Leščić Ašler, I. Tomić, S. Luić, M. Bzowska, A Homooligomerization is needed for stability: a molecular modelling and solution study of E. coli purine nucleoside phosphorylase. FEBS J. 281, 1660-1671 (2014)

Bzowska, A. Kulikowska, E. Shugar, D. Purine nucleoside phosphorylase: properties, functions and clinical aspects, Pharm. Ther. 88: 349-425 (2000).

Koellner, G., Bzowska, A., Wielgus-Kutrowska, B. Luić, M. Steiner, T. Saenger, W. Stępiński, J. 'Open' and 'closed' conformation of the E. coli purine nucleoside phosphorylase active center and implications for the catalytic mechanism, J. Mol. Biol. 315, 351-371 (2002).

Leslie AG, Wonacott AJ (1984) Structural evidence for ligand-induced sequential conformational change in glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 178, 743-772.

Kierdaszuk B, Modrak-Wojcik A, Shugar D (1997). Binding of phosphate and sulphate anions by purine nucleoside phosphorylase from E. coli: ligand-dependent quenching of enzyme intrinsic fluorescence. Biophys. Chem. 63, 107-118.

Mikleusević, M. Stefanić, Z. Narczyk, M. Wielgus-Kutrowska, B. Bzowska, A. Luić, M. Validation of the catalytic mechanism of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase by structural and kinetic studies, Biochimie 93, 1610-1622 (2011).

 

Mulvey RS, Fersht AR (1976) Intersubunit interactions in the methionyl-tRNA syntetase of Bacillus stearothermophilus. Biochem. 15, 243-249.

Norager S, Arent S, Bjornberg O, Ottosen M, Lo Leggio L, Jensen KJ, Larson S (2003) Lactococcus lactis dihydroorotate dehydrogenase A mutants reveal important facets of the enzymetic function. J. Biol. Chem. 278, 28812-28822.

Shi J, Dertouzos J, Gafni A, Steel D, Palfey BA (2006) A single molecule kinetics reveals signatures of half-sites reactivity in dihydroorotate dehydrogenase A catalysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 5775-5780.

Stefanic, Z. Narczyk, M. Mikleusevic, G. Wielgus-Kutrowska, B. Bzowska, A. Luic, M. New phosphate binding sites in the crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase complexed with phosphate and formycin A, FEBS Letters 586, 967-971 (2012).

Wybrane publikacje powstałe w wyniku realizacji projektu

  1. Mikleusević, Z. Stefanić, M. Narczyk, B. Wielgus-Kutrowska, A. Bzowska, M. Luić, Validation of the catalytic mechanism of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase by structural and kinetic studies, Biochimie 93, 1610-1622 (2011).
  2. Stefanic, M. Narczyk, G. Mikleusevic, B. Wielgus-Kutrowska, A. Bzowska, M. Luic, New phosphate binding sites in the crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase complexed with phosphate and formycin A, FEBS Letters 586, 967-971 (2012).
  3. Wielgus-Kutrowska, K. Breer, M. Hashimoto, S. Hikishima, T. Yokomatsu, A. Dyzma, M. Narczyk, A. Girstun, K. Staroń, A. Bzowska, Trimeric purine nucleoside phosphorylase: exploring postulated one-third-of-the-sites binding in the transition-state, Bioorg Med Chem. 20, 6758-6769 (2012).
  4. Bertosa, G. Mikleusevic, B. Wielgus-Kutrowska, M. Narczyk, M. Hajnic, I. Leščić Ašler, S. Tomić, M. Luić, A. Bzowska “Homooligomerization is needed for stability: a molecular modelling and solution study of E. coli purine nucleoside phosphorylase. FEBS J. 281, 1660-1671 (2014)
  5. Wielgus-Kutrowska, A. Modrak-Wójcik, A. Dyzma, K. Breer, M. Zolkiewski. A. Bzowska, Purine nucleoside phosphorylase activity decline is linked to the decay of the trimeric form of the enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics 549, 40-48 (2014)
  6. Stachelska-Wierzchowska, J. Wierzchowski, A. Bzowska, B. Wielgus-Kutrowska. Site-Selective Ribosylation of Fluorescent Nucleobase Analogs Using Purine-Nucleoside Phosphorylase as a Catalyst: Effects of Point Mutations Molecules 21, 44 (2016)
  7. Kazazić, B. Bertoša, M. Luić, G. Mikleušević, K. Tarnowski, M. Dadlez, M. Narczyk, A. Bzowska, New insights into active site conformation dynamics of E. coli PNP revealed by combined H/D exchange approach and molecular dynamics simulation. Journal of The American Society for Mass Spectrometry 27, 73-82 (2016)

Współpraca naukowa

Z ośrodkami zagranicznymi

z grupą badawczą prof. Mariji Luic, Rudjer Boskovic Institute, Laboratorium Krystalografii Chemicznej i Biologicznej, Zagrzeb, Chorwacja

z grupą badawczą dr Branimira Bertosy, Faculty of Science at University of Zagreb, Zagrzeb, Chorwacja

z grupą badawczą prof. Michała Żółkiewskiego, Kansas State University, Department of Biochemistry and Molecular Biophysics,  Manhattan, USA

z grupa badawczą prof. Giovanna Cacciapuoti, Second University of Naples, Department of Biochemistry, Biophysics and General Pathology, Neapol, Włochy

Z ośrodkami w Polsce

z grupą badawczą prof. dr hab. Katarzyny Jagusztyn-Krynickiej, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

z grupą badawczą prof. dr hab. Joanny Trylskiej, Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski

z grupą badawczą prof. dr hab. Joanny Cieśli, Instytut Biotechnologii, Politechnika Warszawska