Struktura przestrzenna i molekularny mechanizm katalizy białek z rodziny fosforylaz nukleozydów purynowych

Krystalograficzna struktura fosforylazy nukleozydow purynowych z Cellulomonas
w kompleksie z fosforanem i 8-J-guaniną

Osoby zaangażowane w projekt
Agnieszka Bzowska
Beata Wielgus-Kutrowska
Marta Narczyk

Współpraca w Zakładzie Biofizyki
Jan Antosiewicz
Anna Modrak-Wójcik

Słowa kluczowe
fosforylazy nukleozydów purynowych
mechanizm katalizy
kinetyka
krystalografia
spektroskopia

Opis projektu

Enzymy katalizują prawie wszystkie reakcje chemiczne zachodzące w organizmach żywych. Poznanie struktury trójwymiarowej enzymów z rozdzielczością atomową, a także molekularnego mechanizmu katalizy i oddziaływania z ligandami, jest nie tylko pasjonującym problemem naukowym, ale w przypadku wielu enzymów ma istotny aspekt praktyczny. Do takich enzymów należą fosforylazy nukleozydów purynowych, których silne selektywne inhibitory są potencjalnymi lekami np. immunosupresyjnymi (ewentualne zastosowanie  przt rtansplantacji narządów lub w terapii białaczek) oraz przeciwpasożytniczymi, a różnice w specyficzności enzymów należących do tej rodziny a pochodzących z różnych organizmów, np. człowieka i bakterii, mogą być wykorzystane w terapii genowej niektórych nowotworów (zobacz Bzowska et al., 2000). Celem naszym jest poznanie struktury i mechanizmu działania enzymów należących do tej rodziny przy zastosowaniu metod dyfraktometrycznych, kinetycznych, spektroskopowych i kalorymetrycznych.

Enzymy homooligomeryczne o bardzo silnej (nieskonczonej) negatywnej kooperacji w wiązaniu ligandów i katalizie: czy natura jest rozrzutna?

Znacząca ilość białek to homooligmery zbudowane z kilku łancuchów polipeptydowych o tej samej sekwencji aminokwasowej. Kooperatywne wiązanie ligandów przez takie białka jest procesem szeroko spotykanym, aczkolwiek kooperacja pozytywna wystepuje zdecydowanie cześciej niż negatywna. Wydaje sie, że nie ma w tym nic dziwnego, gdyż silniejsze wiązanie kolejnych ligandów to wygodny mechanizm regulacyjny zmuszający dane białko do wydajniejszej pracy, gdy pojawia sie wiecej molekuł ligandu do obróbki. Tymczasem kooperacja negatywna na pierwszy rzut oka może być oceniona jako proces destrukcyjny: każda kolejna molekuła ligandu wiązana jest słabiej, a więc narzędzie biologiczne, jakim jest białko wykazujące negatywną koperacje w wiązaniu ligandów, odmawia wydajnej pracy, gdy zwiąże pierwszą molekułę ligandu. Dlaczego zatem białka wykazujące negatywną kooperacje w ogóle wystepują w przyrodzie? A wystepują. Co wiecej, w pewnych pracach pokazano (np. Mulvey and Fersht, 1976, Anderson et al., 1999; Shi et al. 2006), że kooperacje negatywna jest tak silna, iż dochodzi, w przypadku dimerów, do tzw. .half-the-sites binding. (lub także .half-the-sites reactivity., gdy białko wykazuje aktywnośa enzymatyczną) czy też do .part-the-sites binding (reactivity). w przypadku wyższych hoomoligomerów. Logicznym wydaje sie w tej sytuacji postawienie pytania dlaczego białka takie zbudowane są z kilku łancuchów polipeptydowych o tej samej sekwencji, skoro tylko jedna podjednostka wiąże ligand (katalizuje reakcje enzymatyczną). Czy natura jest rozrzutna? Pytanie to nasuneło sie nam w trakcie naszych wieloletnich prac zmierzających do określenia mechanizmu katalizy prowadzonej przez rodzine białek "fosforylaz nukelozydów purynowych", ważnych enzymów targetowych w terapii chorób nowotworowych i chorób układu immunologicznego. Fosforylazy ze ssaków i niektórych innych organzimów są homotrimerami, natomiast szereg fosforylzaz bakteryjnych to hoomoheksamery (Bzowska et al., 2000). Prace nasze (Koellner at al. 1997, 2002; Bzowska 2002, Bzowska et al., 2004, Dlugosz et al., 2005), a także równoległe prace prowadzone przez inne zespoły badawcze (Kline and Schramm, 1992; Kierdaszuk et al., 1997; Miles et al., 1998) wykazały, że (1) fosforylazy trimeryczne wiążą w stanie przejściowym jedną cząsteczke ligandu na trimer, (2) fosforylazy heksameryczne to strukturalnie trimery dimerów; w dimerze jedna podjednostka z dwóch charakteryzuje sie zamknietą konformacją miejsca aktywnego po związaniu ligandu i ligad wiązany jest przez nią silnie, natomiast miejsce aktywne drugiej pozostaje otwarte i ligand wiązany jest o rzedy wielkości słabiej. Podobny mechanizm pokazano też dla kilku innych enzymów (np. Leslie 1984; Norager et al., 2003). W proponowanym projekcie pragniemy odpowiedzieć miedzy innymi na pytanie czy w przypadku fosforylaz, a także innych białek wykazujących zjawisko "part-the-sites binding (reactivity)" natura okazała sie rozrzutna czy też wspomniany mechanizm przynosi jednak fosforylazom i innym białkom charakteryzujących sie tym zjawiskiem jakąś korzyśa, a jeśli tak, to jaką. Nasze badania bedą obejmować kilka zagadnień: a) badania bioinformatyczne i przegląd literatury w celu ustalenia, jak wiele białek z opisanych w literaturze i o skatalogowanej w Protein Data Bank strukturze przestrzennej to homooligomery w sensie sekwencji, jak wiele z nich to heterooligomery w sensie struktury i dla jakich białek opisano wystepowanie zjawiska "part-the-sites binding (reactivity)", b) szczegółowe badania eksperymentalne i molerularne modelowanie trimerycznych i heksamerycznch fosforylaz i ich mutantów (cielecej i z E. coli) w celu określenia stechiometrii wiąznia i katalizy różnych ligandów, a także badania takimi metodami jak wymiana H/D i anizotropia emisji w celu zbadania, jakie obszary białka usztywniają sie w wyniku związania ligandu i jak informacja o związaniu ligandu w jednej podjednostce przenosi sie do innej, c) zaprojektowanie, uzyskanie i zbadanie właściwości katalitycznych modelowej fosforylazy dimerycznej (o zdestabilizowanych kontaktach pomiedzy dimerami w trimerze dimerów) i modelowej fosforylazy monomerycznje (o zdestabilizowanych kontaktach pomiedzy monomerami w trimerze), d) konstrukcja ("design") nowych ligandów fosforylaz do badan zjawiska "part-the-sites binding" (niektóre z tych związków - inhibitory fosforylazy trimerycznej - mają także potencjalne znaczenie farmakologiczne) oraz synteza nietórych z zaprojektowanych analogów, nowych inhibitorów PNP, np. fosfonianów acyklicznych nukleozydów purynowych i ich analogów łatwiej przenikających przez błone komórkową (potencjalnych proleków), charakterystyka ich oddziaływania z rekombinowanym PNP cielęcym i przeprowadzenie wstępnych badań biologicznych mających na celu sprawdzenie potencjalnego znaczenia farmakologicznego zsyntetyzowanych analogów. To interdyscyplinarne podejście powinno zaowcować odpowiedzią na pytanie, jak powszechny jest mechanizm "part-the-sites binding (reactivity)" i pozwolić na postawienie hipotezy, w jakim celu przyroda go wytworzyła. Uzyskane wyniki mają więc przede wszystkim znaczenie podstawowe: zbadanie zauważonego niedawno zjawiska charakteryzującego funkcjonowanie szeregu białek, jak i, potencjalnie, aplikacyjne, bowiem odpowiedz na pytanie, jaką korzyść wspomniany mechanizm przynosi, może umożliwić wykorzystanie go do konstrukcji białek o zmienionych przez nas/udoskonalonych właściwościach, a konstrukcja nowych ligandów PNP może doprowadzia do uzyskania potencjalnego leku immunosupresyjnego czy przeciwnowotworowego.

Wybrane publikacje

  1. A. Bzowska, M. Luić, W. Schröder, D. Shugar, W. Saenger and G. Koellner, Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: purification, sequence and crystal structure of its complex with N(7)-acycloguanosine inhibitor, FEBS Letters 367, 214-218 (1995).
  2. A. Bzowska, E. Kulikowska, N. E. Poopeiko and D. Shugar, Kinetics of 3-(ż-D-ribofuranosyl)adenine and 3-(ż-D-ribofuranosyl)hypoxanthine, non-conventional substrates of purine nucleoside phosphorylase, Eur. J. Biochem. 239, 229-234 (1996).
  3. G. Koellner, M. Luić, D. Shugar, W. Saenger and A. Bzowska, Crystal structure of calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 ż resolution, J. Mol. Biol. 265, 202-216 (1997).
  4. G. Koellner, M. Luić, D. Shugar, W. Saenger and A. Bzowska, Crystal structure of the ternary complex of E. coli purine nucleoside phosphorylase with formycin B, a structural analogue of the substrate inosine, and phosphate (sulphate) at 2.1 ż resolution, J. Mol. Biol. 280, 153-166 (1998).
  5. E. Kulikowska, A. Bzowska, A. Holy, L. Magnowska and D. Shugar, Antiviral acyclic nucleoside phosphonate analogues as inhibitors of purine nucleoside phosphorylase, Adv. Exp. Med. Biol. 431, 747-752 (1998).
  6. J. Tebbe, A. Bzowska, B. Wielgus-Kutrowska, W. Schröder, Z. Kazimierczuk, D. Shugar, W. Saenger, W. and G. Koellner, Crystal structure of purine nucleoside phosphorylase (PNP) from Cellulomonas sp. and its implications of the molecular mechanism of trimeric PNPs, J. Mol. Biol. 294, 1239-1255 (1999).
  7. A. Bzowska, E. Kulikowska and D. Shugar, Purine nucleoside phosphorylase: properties, functions and clinical aspects, Pharm. Ther. 88: 349-425 (2000).
  8. M. Luić, G. Koellner, D. Shugar, W. Saenger and A. Bzowska, Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: structure of its ternary complex with an N(7)-acycloguanosine inhibitor and a phosphate anion, Acta Cryst. D57, 30-36 (2001).
  9. G. Koellner, A. Bzowska, B. Wielgus-Kutrowska, M. Luić, T. Steiner, W. Saenger and J. Stępiński, 'Open' and 'closed' conformation of the E. coli purine nucleoside phosphorylase active center and implications for the catalytic mechanism, J. Mol. Biol. 315, 351-371 (2002).
  10. A. Bzowska, Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: complex kinetic mechanism, hydrolysis of 7-methylguanosine, and oligomeric state solution, Biochim. Biophys. Acta 1596, 293-317 (2002).

Finansowanie (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)

Trzyletni grant: "Enzymy homooligomeryczne o bardzo silnej (nieskonczonej) negatywnej kooperacji w wiązaniu ligandów i katalizie: czy natura jest rozrzutna?" (kierownik Dr. Agnieszka Bzowska, 2010-2013)

Roczny grant: "Mechanizm wiązania ligandów oraz komunikacji pomiędzy podjednostkami cielęcej fosforylazy nukleozydów purynowych - badania mutantów o zmienionych właściwościach fluorescencyjnych" (kierownik Dr. Agnieszka Bzowska, 2008-2009)